王永明/柴人杰课题组开发出新型小型化CRISPR-Cas9工具

发表时间:2021/12/11 16:13:00  
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CRISPR-Cas9,这种更便捷的基因编辑工具,为人类研究基因和疾病,进行基因治疗带来了革命性改变。但应用最广泛的来自化脓链球菌的spCas9太大了,以至于难以使用腺相关病毒(AAV)包装递送,这极大地限制了CRISPR-Cas9技术进行体内基因编辑。


因此,国内外许多研究团队致力于找到蛋白序列小于1100个氨基酸的小型化CRISPR-Cas9,从而可以使用AAV递送,实现高效的体内基因编辑。

CRISPR-Cas9基因编辑的位点处需要有一个叫做PAM的序列,它限制了Cas9在基因组中的编辑范围。不同的Cas9识别的PAM序列不一样,从自然界中寻找新的Cas9核酸酶可以扩大编辑范围。2015年张锋课题组开发了来自金黄色葡萄球菌的SaCas9,得到了广泛的应用。但是SaCas9识别NNGRRT PAM,编辑范围小。2019年Sontheimer课题组开发出了Nme2Cas9,识别简单的NNNNCC PAM;2020年和2021年复旦大学王永明课题组相继开发出SauriCas9和SlugCas9,识别简单的NNGG PAM。这些工具极大的扩展了编辑范围。

2021年12月7日,复旦大学王永明课题组联合东南大学柴人杰课题组在 Advanced Science 上发表了题为:Compact SchCas9 Recognizes the Simple NNGR PAM 的研究论文。

该研究进一步扩大了CRISPR基因编辑的范围,筛选到了15个有编辑活性的Cas9。其中SchCas9含有1054个氨基酸,识别NNGR PAM(R=A/G,图1),平均每4个碱基就有一个编辑位点,与之前的小型Cas9相比,编辑范围扩大了一倍

随后,研究团队在人类基因组上随机选取了十几个位点,进行编辑效率测试,发现SchCas9对含有NNGA和NNGG PAM序列都能编辑。在NNGA PAM处的编辑效率显著高于SauriCas9。接着研究团队根据SaCas9和SchCas9构建了Sa-SchCas9嵌合体,该嵌合体同样识别NNGR PAM,且具有更高的编辑效率。

最后,研究团队用GFP荧光报告系统,将SchCas9、Sa-SchCas9和SaCas9的特异性进行比较,结果证明,SchCas9和Sa-SchCas9特异性明显高于SaCas9


总而言之,该研究开发出了多个小型CRISPR-Cas9系统,扩展了编辑范围,扩大了CRISPR工具库,为基因治疗及基础研究提供了新的基因编辑系统


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